2014 ~ بِسْمِ اللَّهِ الرَّحْمَنِ الرَّحِيم

Ø Tujuan :

- memahami prinsip identifikasi dan mampu melakukan salah satu teknik identifikasi bakteri dgn pengecatan gram

- memahami penggunaanya dlm tindakan klinik

Ø Prinsip pewarnaan gram

1. Dinding sel bakteri gram positif terdiri atas lapisan Peptidoglikan yang tebal menjadikan afinitasnya tinggi terhadap Kristal violet dan iod membentuk senyawa sukar larut dalam alkohol, sehingga tetap memegang kuat zat utama ( berwarna ungu ).

2. Dinding sel bakteri gram negatif mengandung lapisan lemak dan karbohidrat yang afinitasnya rendah terhadap cat utama dan mudah luntur atau larut dalam alkohol, selanjutnya akan menerima atau memegang cat lawan ( berwarna merah ).

Ø Klasifikasi bakteri :

- Mnrt bentuk sel : batang:bacillus, kokus:enterococcus, spiral

- pengelompokan sel : berpasangan:Enterococus, berkelompok:staphylococcus, rantai:streptococcus

- kemampuan mempertahankan warna

- kondisi pertumbuhannya

Ø Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme.

Ø Dengan metode pengecatan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.

Ø Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya.

Ø Spesimen yang akan dicat, sebelumnya dibuat sediaan atau preparat terlebih dulu. Pengertian preparat adalah sampel spesimen yang diletakkan atau dioleskan pada permukaan gelas obyek (object glass) atau slides, dengan atau tanpa pewarnaan, yang selanjutnya dapat diamati di bawah mikroskop.

Ø Alat dan bahan yang diperlukan adalah :

Alat :

§ Ose atau kapas lidi steril

§ Gelas obyek

§ Lampu spiritus

Bahan :

§ Bahan yang akan diperiksa.

§ Kaldu nutrien

§ Spesimen

- Sputum :dahak

- Pus :nanah

- Discharge telinga

- Discharge hidung

- Urin

Bahan langsung dari penderita

Panaskan gelas obyek di atas nyala api lampu spiritus sambil diayunkan secukupnya (jarak preparat sampai nyala api kira-kira 20 cm), sampai preparat tersebut kering. Setelah kering, teteskan formalin 1 % tunggu selama 5 menit dan keringkan sekali lagi. Setelah betul-betul kering, preparat siap dicat.

Bahan dari biakan cair

Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Ambil kuman dari biakan cair (yang sebelumnya telah diaduk secara steril) dengan menggunakan ose steril, ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter kira-kira 1-2 cm. Preparat yang sudah dibuat kemudian dikeringkan dan ditetesi formalin dengan cara seperti pembuatan preparat langsung.

Bahan dari media pertumbuhan padat

Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan memanaskan di atas nyala api spiritus. Teteskan satu ose kaldu pada gelas obyek tersebut. Dengan ose steril, ambil satu koloni kuman dan ratakan pada gelas obyek sehingga membentuk diameter 1 – 2 cm, campur dengan kaldu tadi sampai homogen kemudian tipiskan. Selanjutnya dikerjakan sebagaimana membuat preparat dengan bahan berasal dari penderita.

a. Cat Gram

1. Cat Gram A

Cat ini terdiri atas :

Kristal violet : 2 gram

Etil alkohol 95 : 20 ml

Ammonium oksalat : 0,8 gram

Akuades : 80 ml

Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat Gram A merupakan cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme target. Pada saat diberi cat ini, semua mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A.

2. Cat Gram B

Cat ini terdiri atas :

Yodium : 1 gram

Kalium Yodida : 2 gram

Akuades : 300 ml

Cat Gram B berwarna coklat. Cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. Akibat pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).

3. Cat Gram C

Cat ini terdiri atas :

Aseton : 50 ml

Etil alkohol 95 % : 50 ml

Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya. Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan :

§ Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian disebut bakteri Gram positif.

§ Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif.

4. Cat Gram D

Cat Gram D terdiri atas :

Safranin : 0,25 gram

Etil alkohol 95 % : 10 ml

Akuades : 90 ml

Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan :

Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram D.

Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu mengikat cat Gram D

Dasar teori cat Gram

Berdasarkan sifat terhadap cat Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi 2 yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Terdapat dua teori yang dapat menjelaskan dasar perbedaan ini yaitu :

1. Teori Salton

Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi (20 %) di dalam dinding sel bakteri Gram negatif. Zat lipid ini akan larut selama pencucian dengan alkohol. Pori-pori pada dinding sel membesar, sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna.

Bakteri Gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding selnya akibat pencucian dengan alkohol. Protein menjadi keras dan beku, pori-pori mengecil sehingga kompleks kristal yodium yang berwarna ungu dipertahankan dan bakteri akan tetap berwarna ungu.

2. Teori permeabilitas dinding sel

Teori ini berdasarkan tebal tipisnya lapisan peptidoglikan dalam dinding sel. Bakteri Gram positif mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Permeabilitas dinding sel kurang, dan kompleks kristal yodium tidak dapat keluar.

Bakteri Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis, hanya 1 – 2 lapisan dan susunan dinding selnya tidak kompak. Permeabilitas dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks kristal yodium.

KELEBIHAN DAN KEKURANGAN PENGECATAN GRAM

Kelebihan :

Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik.
Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik.

Kekurangan :

Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 10⁴ per ml.

Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis.

1. Bacillus subtilis